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Osteointegración y biocompatibilidad in vivo de cerámicas bioinspiradas de carburo de silicio en un modelo experimental en conejo

ORIGINALES ( PDF )   Rev Osteoporos Metab Miner 2012 4;4:127-132

Guede D1,2, Pereiro I3, Solla E3, Serra J3, López-Peña M4, Muñoz F4, González-Cantalapiedra A4, Caeiro JR2,5, González P3

1 Trabeculae - Empresa de Base Tecnológica, S.L. - Ourense
2 Red Temática de Investigación en Envejecimiento y Fragilidad (RETICEF) - Instituto de Salud Carlos III - Ministerio de Economía y Competitividad - Madrid
3 Grupo de Nuevos Materiales - Departamento de Física Aplicada - Universidad de Vigo - Pontevedra
4 Departamento de Ciencias Clínicas Veterinarias - Facultad de Veterinaria - Universidad de Santiago de Compostela - Lugo
5 Servicio de Cirugía Ortopédica y Traumatología - Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela - A Coruña

PALABRAS CLAVE: carburo de silicio, sustitutos óseos, osteointegración, técnicas histológicas, microtomografía computarizada de rayos X.


Fundamento: La nueva generación de materiales para implantes debe imitar las estructuras jerárquicas de la naturaleza. El carburo de silicio bioinspirado (bioSiC) es una cerámica producida a partir de madera, que presenta una estructura similar al hueso, con la propiedad única de una porosidad interconectada, que permite el crecimiento interno de los tejidos y favorece la angiogénesis.
Objetivos: Valorar la biocompatibilidad y osteointegración del bioSiC en defectos óseos femorales en un modelo experimental en conejo.
Material y métodos: Se obtuvieron 36 cilindros de bioSiC mediante pirólisis de madera de sapelli e infiltración con silicio fundido de la preforma de carbono resultante. Dieciocho cilindros se recubrieron con Si-HA por deposición con láser pulsado. Los cilindros se implantaron en cóndilos femorales de conejos que se sacrificaron a las 1, 4 ó 12 semanas. Las muestras se analizaron histológicamente mediante microscopía óptica y por microtomografía computarizada para evaluar el crecimiento de hueso.
Resultados: Los implantes de bioSiC mostraron una buena osteointegración presentando tanto crecimiento hacia fuera (ongrowth) como hacia dentro (ingrowth). A las 4 semanas de la implantación la integración era casi completa, sin diferencias frente a las 12 semanas. El recubrimiento no mejora el valor de ningún parámetro con respecto a los implantes no recubiertos.
Conclusiones: Las cerámicas de bioSiC fabricadas a partir de madera porosa presentan una buena osteointegración y su porosidad interconectada es colonizada por el tejido óseo. No requieren además la bioactividad de un revestimiento para mejorar la aposición de hueso neoformado. El bioSiC se erige como un material a tener en cuenta en aplicaciones biomédicas.

Introducción
Tradicionalmente, los defectos óseos se han tratado implantando tejido autólogo (procedente del propio paciente), alogénico (procedente de otro individuo de la misma especie) o xenogénico (obtención de hueso de un animal de otra especie), o bien implantando materiales sustitutos. Los autoinjertos, aunque han mostrado un alto porcentaje de éxito, se ven limitados por la cantidad de tejido que puede extraerse y por la morbilidad del sitio de extracción [1]. Por su parte, los aloinjertos y los xenoinjertos (estos últimos mucho menos utilizados) pueden causar reacciones inmunes y transmitir patógenos al paciente. Con respecto a los sustitutos óseos sintéticos, todos ellos gozan de una serie de ventajas sobre los injertos de hueso, como su ilimitada disponibilidad o su sencilla esterilización. Sin embargo, a pesar de su gran variabilidad, el principal problema de todos estos materiales es su limitación para proporcionar soporte mecánico a la zona afectada [2]. Las demandas actuales de la ingeniería de tejidos para la regeneración de tejido óseo plantean nuevos retos en ciencia de materiales e ingeniería biomédica. Así surge una tendencia tecnológica basada en la biomimética para el desarrollo de nuevos biomateriales, que se inspiran en los modelos y bioestructuras que nos ofrece la naturaleza, y que han sido perfeccionados y optimizados a lo largo del proceso evolutivo.
Los materiales cerámicos bioinspirados, basados en precursores naturales como madera, plantas o algas, reúnen varios de los requisitos que se le exigen a esa nueva generación de biomateriales: buenas prestaciones biomecánicas, ligeros, tenaces y con una estructura con porosidad jerarquizada e interconectada que se asemeja al tejido óseo para favorecer el crecimiento de tejido en su interior y la angiogénesis, es decir, la osteointegración del material en el tejido huésped [3]. Las cerámicas de carburo de silicio bioinspiradas (bioSiC) reúnen los requisitos biomecánicos adecuados para utilizarse como sustituto óseo. Estas cerámicas pueden ser fabricadas a partir de diversas estructuras naturales [4,5]. El proceso tecnológico de fabricación se basa en la ceramización de los precursores naturales, obteniéndose como resultado final una pieza de carburo de silicio con una porosidad interconectada que mantiene la jerarquía estructural en cuanto a tamaño y distribución de poros del original.
Los ensayos mecánicos indican que las propiedades de estos materiales pueden ser ajustadas a medida, mediante una selección apropiada del precursor vegetal de partida, dependiendo de las características del tipo de hueso que se pretenda reparar, y modificando las condiciones experimentales de fabricación. Así, a semejanza del hueso, cabe señalar que el bioSiC presenta propiedades mecánicas anisotrópicas con valores que se comparan positivamente con los del hueso. A modo de ejemplo, el bioSiC obtenido a partir de madera de sapelli (Entandrophragma cylindricum) presenta valores de resistencia a la compresión en dirección longitudinal (eje de crecimiento del árbol) de 210±20 a 1.160±100 MPa, y en dirección radial desde 120±10 a 430±50 MPa, en función de la cantidad de Si infiltrado [6,7]. La resistencia a la compresión de especímenes de hueso cortical humano varía entre 167 y 215 MPa [8].
La biocompatibilidad de un material se refiere a la capacidad de funcionar como un sustrato que soportará la actividad celular apropiada, facilitando los sistemas de señalización molecular y mecánica, con el fin de optimizar la regeneración de los tejidos, sin provocar reacciones indeseables en el huésped [9]. El objetivo de este estudio ha sido comprobar la capacidad de osteintegración de cerámicas de bioSiC en un modelo animal de defecto óseo en conejo, comprobando su biocompatibilidad in vivo mediante la comparación de implantes sin recubrimiento e implantes con un recubrimiento bioactivo.

Material y métodos
Fabricación de SiC bioinspirado
El proceso de fabricación de las cerámicas bioinspiradas consiste en dos fases básicas. La primera de ellas es el proceso de pirolización, donde el precursor natural seco o liofilizado se somete a alta temperatura en condiciones inertes. Se procede al calentamiento de la muestra con una rampa controlada de 2°C/min hasta 600-800°C; se mantiene a esta temperatura durante 1 h y se enfría lentamente hasta temperatura ambiente. El material resultante es una proforma carbonácea que mantiene todos los detalles bioestructurales del sistema vascular del precursor original.
La segunda fase consiste en un proceso de infiltración, donde la proforma de carbón se cubre con polvo de silicio y se expone a alta temperatura en un horno controlable en condiciones de vacío. Se alcanza una temperatura de 1.550°C, a razón de 5-10°C/min, se mantiene 30 min a temperatura máxima, se procede al enfriado controlado a 20°C/min y se obtiene una pieza de carburo de silicio.
Para este estudio se obtuvieron 36 cilindros de bioSiC a partir de madera de sapelli, de los cuales 18 se recubrieron con Si-HA (7,5 at. %) mediante deposición por láser pulsado (PLD). La fabricación de los recubrimientos de Si-HA se llevó a cabo con un láser excímero (193 nm, 175 mJ y 10 Hz) a partir de una pastilla sintética de hidroxiapatita (HA) y silicio en polvo (7,5 at. % de Si). El depósito se realizó en una atmósfera de vapor de agua (0,45 mbar) manteniendo el sustrato de bioSiC a 460°C durante el crecimiento del recubrimiento.

Modelo animal
Para investigar la biocompatibilidad in vivo del material, se diseñó un modelo experimental de defecto óseo en fémur de conejo. Los cilindros de bioSiC se implantaron en los cóndilos laterales de los fémures de 18 conejos New Zealand, para lo que se realizó un abordaje lateral longitudinal distal sobre el muslo de ambas extremidades. Con una broca se practicó un orificio en la epífisis distal del fémur donde se implantó aleatoriamente un cilindro de bioSiC sin recubrimiento o un clilindro de bioSiC con recubrimiento bioactivo de Si-HA. Los animales se sacrificaron mediante administración intravenosa de pentobarbital sódico a las 1, 4 y 12 semanas tras la implantación y se obtuvieron las muestras que fueron fijadas en formol tamponado al 10%. De este modo, se obtuvieron 6 grupos experimentales (n=6), los tres primeros con implantes sin recubrimiento a los tres tiempos de estudio, y los tres últimos con implantes recubiertos. Todos los experimentos se han llevado a cabo conforme a la Ley 14/2007 y al Real Decreto 1201/2005, y siguiendo las directrices de las normas UNE-EN 30993-3:1994 e ISO 10993-2:2006.

Análisis histológico
Las muestras se procesaron para su estudio utilizando las técnicas de inclusión en metacrilato descritas por Donath [10] siguiendo los pasos de fijación, deshidratación, infiltración, inclusión y polimerización. Posteriormente se realizaron secciones longitudinales del cóndilo del fémur de aproximadamente 30 µm de espesor, que fueron teñidas mediante la tinción de Lévai-Laczkó.
Una vez preparadas, las muestras se observaron con lupa binocular y se estimó la fracción del área total de poros ocupada por hueso, la cantidad de hueso neoformado en la periferia del implante y el porcentaje de la superficie del implante en contacto con hueso [11]. La calibración posterior se realizó con la aplicación informática Microimage.

Análisis mediante micro-CT
La formación de hueso alrededor del implante se analizó también mediante microtomografía computarizada (micro-CT). Las muestras se escaneron mediante un microtomógrafo de rayos X de alta resolución SkyScan 1172 (Bruker micro CT NV, Kontich, Bélgica) a 60 kV y 167 µA de intensidad de la fuente de rayos X. Se empleó una resolución nominal de 7,90 µm y un filtro de Al de 1 mm de grosor para obtener un intervalo restringido de longitudes de onda. El paso de rotación fue de 0,2° con una rotación total de 360° y un valor de frame averaging (imágenes por paso) de tres. Las imágenes obtenidas se reconstruyeron mediante el algoritmo de Feldkamp modificado [12] y se analizaron mediante la aplicación comercial CTAnalizer (Bruker micro CT NV, Kontich, Bélgica). Para ello, se seleccionó un volumen de interés de un grosor de 160 µm desde la superficie del implante, en el que se determinó la fracción volumétrica ósea (BV/TV). Se calculó además la superficie de intersección del hueso con el implante refiriéndola a la superficie total del implante (i.S/TS).

Análisis estadístico
Los datos recogidos del estudio se introdujeron en una base de datos de texto que se exportó posteriormente al paquete estadístico SPSS 18.0 (IBM, Armonk, NY, USA) para su posterior análisis estadístico. Seguidamente se procedió con el análisis descriptivo de las variables de estudio. Los datos estadísticos descriptivos de las variables numéricas se expresaron como media ± desviación estándar.
El estudio estadístico comparativo de todos los resultados numéricos obtenidos para los distintos grupos de estudio se llevó a cabo mediante la aplicación del test U de Mann-Whitney debido a que las variables no superaban los criterios de normalidad aplicados. La relación existente entre los resultados obtenidos mediante histología y micro-CT se estudió con la correlación de Pearson.
El nivel de significación estadística se estableció en valores de p<0,05 para todas las variables analizadas.

Resultados
La biocompatibilidad in vitro de las cerámicas de bioSiC se demostró mediante el cultivo de la línea celular osteoblástica humana MG-63 en un estudio previo [7]. Para investigar la biocompatibilidad in vivo de estas biocerámicas se llevó a cabo un modelo experimental en fémur de conejo. Los cortes histológicos obtenidos de las muestras tras la implantación se examinaron mediante microscopía óptica y microtomografía computarizada.
Mediante el análisis histológico, se puede observar crecimiento de hueso neoformado en la superficie de los implantes, no apreciándose signos de inflamación ni aparición de tejido fibroso alrededor de las muestras. Es destacable que el hueso neoformado penetra por los poros de la misma. A mayores aumentos en el microscopio podemos comprobar dicha colonización así como el contacto óseo con el implante, lo cual representa una característica resaltable (Figura 1).
En los implantes sin recubrimiento, a la primera semana de implantación se observa que un 10,38% del área de poros ha sido colonizada por hueso nuevo, porcentaje que aumenta hasta el 37,52% a las 4 semanas (p=0,017). En el área seleccionada en la periferia del implante, el hueso neoformado a la primera semana ocupa el 21,25%, mientras que a las 4 semanas es del 32,30% (p=0,030). A las 12 semanas no se observan diferencias en ninguna variable con respecto a las muestras de las 4 semanas (Figura 2).
En el análisis con micro-CT, la región de interés seleccionada para el análisis del crecimiento de hueso fue de 160 µm desde la superficie del implante. Tras la primera semana de la colocación de los implantes de bioSiC, el BV/TV de la región analizada fue de 11,49%, lo que implica que del volumen analizado alrededor del implante, dicho porcentaje estaba ocupado por hueso. A las 4 semanas, el BV/TV se incrementó hasta 45,36% (p=0,030 vs. 1ª semana). El valor a las 12 semanas no muestra diferencias significativas frente al valor de las 4 semanas. Del mismo modo, la i.S/TS, que representa el porcentaje de la superficie del implante en contacto con hueso, aumenta hasta la cuarta semana, tras la cual su valor parece estabilizase, quedando aproximadamente la mitad de la superficie del implante en contacto con hueso neoformado. No se han encontrado tampoco diferencias entre los grupos de las 4 y 12 semanas (Figuras 2 y 3).
Se ha estudiado la relación existente entre los resultados obtenidos con ambas técnicas, mediante correlación de Pearson. El BV/TV calculado por micro-CT presenta una correlación positiva con el porcentaje de hueso neoformado en la periferia determinado mediante histología (r=0,588, p<0,001); de igual modo que la superficie de intersección microtomográfica (i.S/TS) con el porcentaje de contacto óseo histológico (r=0,677, p<0,001) (Figura 4).

Discusión
La naturaleza ofrece una gran variedad de especies con porosidad muy diversa, por lo que debemos seleccionar el precursor original más adecuado para la estructura ósea que se desee replicar. Entre sus características comunes destaca la disposición de una estructura porosa jerárquica que se replica en las cerámicas bioinspiradas.
En el caso del sapelli, observamos una combinación de macrocanales con un diámetro entre 80 y 100 µm, que tienen incidencia en la promoción de la vascularización, transporte de nutrientes y productos de desecho: También se observan microporos de unos 4 µm que participan en la formación de la capilaridad [7]. Por otro lado, es destacable la presencia de poros en la escala nanométrica, que juegan un papel interesante en aspectos relacionados con la difusión molecular para la nutrición y señalización. La interconexión de los poros proporciona el canal para la migración celular y permite la formación de vasos sanguíneos; y la rugosidad del material contribuye a incrementar el área superficial favoreciendo la adsorción de proteínas y el intercambio iónico [3].
De los valores obtenidos tanto mediante el análisis histológico como del análisis microestructural con micro-CT se deduce que la osteointegración se completa a las 4 semanas. Ninguno de los parámetros analizados por una u otra técnica muestra diferencias significativas entres las muestras de 4 y 12 semanas, ya sea en las muestras con recubrimiento o en las que carecen de él. Las muestras en las que se ha aplicado el recubrimiento de Si-HA no presentan diferencias significativas frente a las muestras de bioSiC sin recubrimiento para ninguna de las variables analizadas. De este hecho se deduce que las cerámicas bioinspiradas de SiC no necesitan de la aportación del recubrimiento para resultar biocompatibles, y el recubrimiento no mejora su contacto con el hueso.
Las cerámicas bioinspiradas de carburo de silicio presentan por tanto un alto potencial como nuevo biomaterial para aplicaciones biomédicas. Se demuestra la viabilidad de producción de dispositivos cerámicos ligeros, tenaces y con porosidad interconectada susceptibles de utilizarse como sustituto óseo. Los ensayos in vivo de implantes de bioSiC indican que la porosidad de este biomaterial es colonizada por tejido óseo y se favorece su mineralización. También se comprueba que presenta una buena aposición de hueso neoformado y una adecuada osteointegración en tiempos relativamente cortos tras la implantación.









BIBLIOGRAFÍA:

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