La revista sigue las normas Uniform
Requirements for Manuscripts
Submitted to Biomedical Journals
La Revista suscribe los principios del "Comité sobre la ética en las publicaciones"
Español English
    Empresas colaboradoras:
grunenthal lacer amgen amgen amgen amgen
Estás en > Inicio / Detalle de artículo

Asociación del polimorfismo 1G>2G de la MMP1 con calcificación de la válvula aórtica

ORIGINALES ( PDF )   Rev Osteoporos Metab Miner 2016 8;4:115-120

Solache-Berrocal G1, Barral A2,4, Martín M3, Román-García P1, Llosa JC2, Naves-Díaz M1, Cannata-Andía JB1, Rodríguez I1

1 Servicio de Metabolismo Óseo y Mineral - Instituto Reina Sofía de Investigación - Hospital Universitario Central de Asturias - Universidad de Oviedo - REDinREN del Instituto de Salud Carlos III - Oviedo (España)
2 Servicio de Cirugía Cardiaca - Área del Corazón - Hospital Universitario Central de Asturias - Oviedo (España)
3 Servicio de Cardiología - Área del Corazón - Hospital Universitario Central de Asturias - Oviedo (España)
4 Servicio de Cirugía Cardiovascular - Hospital Universitario Miguel Servet - Zaragoza (España)

PALABRAS CLAVE: valvulopatía aórtica, metaloproteasa de matriz extracelular, polimorfismos, microCT, contenido en calcio.


Introducción: La causa más frecuente de estenosis aórtica es la acumulación activa de calcio en los velos valvulares, lo que conlleva graves consecuencias clínicas. Diversas metaloproteasas de matriz extracelular (MMPs) han sido implicadas en el desarrollo de esta enfermedad. Por ello, se estudió la posible asociación entre un polimorfismo funcional de MMP1 y la cantidad de calcio depositado en la válvula aórtica.

Pacientes y métodos: Se incluyeron en el estudio 45 pacientes sometidos a reemplazo valvular. El contenido en calcio de los velos de las válvulas extraídas en la cirugía se determinó mediante microtomografía computarizada. De muestras de sangre periférica se extrajo ADN para genotipar el polimorfismo -1607 1G>2G de MMP1 por PCR y posterior digestión.

Resultados: Se observaron diferencias significativas en el contenido en calcio de las válvulas aórticas en individuos con distintos genotipos de -1607 1G>2G (p=0,042). Así, los portadores del alelo 2G (en homocigosis o heterocigosis) presentan valores más altos de calcio medido tanto como DMO (p=0,004) como BV/TV (p=0,002). La asociación con BV/TV fue independiente del sexo, la edad, el grado de función renal y la anatomía de la válvula (p=0,02), y se observó también una tendencia con la DMO (p=0,07).

Conclusión: La asociación entre el polimorfismo 1G>2G de MMP1 y el contenido en calcio de la válvula aórtica sugiere que el alelo 1G tendría un efecto protector ante el depósito de calcio. Estos resultados apoyarían la importancia de ampliar el estudio para confirmar si este polimorfismo se podría usar como un posible predictor del desarrollo de estenosis aórtica.

Introducción

La estenosis aórtica por degeneración es la valvulopatía más frecuente en los países desarrollados [1]. Inicialmente considerada un proceso pasivo, en la actualidad se describe como una acumulación activa de calcio en los velos valvulares, acompañada de cambios en la morfología y función de las células valvulares, caracterizados por una marcada diferenciación osteoblástica que aumenta la rigidez valvular. Todo ello lleva a una reducción en el orificio de apertura de la válvula y un incremento en el gradiente de presión de sangre que la atraviesa, con graves consecuencias clínicas [2].

Existen numerosas evidencias que implican a las metaloproteasas de matriz extracelular (MMPs) en este proceso [3]. Las MMPs constituyen una amplia familia de enzimas dependientes de zinc que ejercen su función tanto en condiciones fisiológicas como patológicas [4]. Tradicionalmente se han agrupado según su capacidad para degradar diversos componentes de la matriz extracelular, aunque también ejercen funciones en otras localizaciones. De hecho, de manera reciente se ha sugerido que actúan también sobre proteínas no relacionadas con la matriz y se destaca su papel en procesos inflamatorios [5,6]. Además, se ha encontrado una mayor expresión de MMP-1, -2 y -3 en válvulas aórticas calcificadas que en válvulas aórticas normales, así como la presencia de MMP-9 exclusivamente en válvulas enfermas [7].

La asociación de las MMPs con valvulopatías también se ha estudiado desde el punto de vista genético. Así, se ha descrito que el polimorfismo 1G>2G de la posición -1607 del gen MMP1 se asocia con la presencia de válvula aórtica bicúspide [8]. Este mismo polimorfismo también se ha asociado con los niveles de densidad mineral ósea en mujeres postmenopáusicas [9]. En función de los datos expuestos y con objeto de identificar un posible marcador precoz de enfermedad de la válvula aórtica calcificada, se estudió la asociación del polimorfismo 1G>2G con parámetros indicativos de mineralización en válvulas aórticas procedentes de reemplazo valvular.

Pacientes y métodos

Población

Se estudiaron las válvulas aórticas procedentes de 45 pacientes con diagnóstico de valvulopatía aórtica (91% estenosis, 9% insuficiencia) sometidos a recambio valvular aórtico entre abril de 2012 y mayo de 2014 en el Servicio de Cirugía Cardiaca del Hospital Universitario Central de Asturias. En la tabla 1 se muestran algunas características de mayor interés clínico, incluidos factores de riesgo cardiovascular.

Se consideró fumador actual a cualquier individuo fumador activo durante el último año, ex-fumador a aquel individuo que haya abandonado el hábito tabáquico en un periodo mayor a un año y no fumador a aquella persona que nunca haya adquirido el hábito tabáquico. La dislipemia se definió de acuerdo al cumplimiento de alguno de los siguientes criterios: historia de hiperlipidemia diagnosticada y/o tratada con medicación, dieta y/o ejercicio, cifras de colesterol total superior a 200 mg/dl, colesterol-LDL superior o igual a 130 mg/dl, colesterol-HDL inferior a 40 mg/dl o tratamiento hipolipemiante. La hipertensión arterial se definió como el cumplimiento de alguno de los siguientes criterios: historia de hipertensión diagnosticada o tratada con medicación, dieta y/o ejercicio; presión arterial sistólica igual o superior a 140 mmHg o diastólica igual o superior a 90 mmHg, al menos en dos determinaciones; o tratamiento antihipertensivo que no es administrado como terapia a otra alteración distinta a la hipertensión arterial. Se consideró la existencia de diabetes mellitus en función de la presencia de alguna de las siguientes premisas: historia de diabetes mellitus acreditada en un informe médico, glucemia en ayunas superior o igual a 200 mg/dl en cualquier situación y síntomas de diabetes mellitus, al menos dos determinaciones de glucemia en ayunas superiores o iguales a 126 mg/dl (entendiéndose como ayunas un periodo sin ingesta de al menos 8 horas) o utilización actual de tratamientos hipoglucemiantes orales y/o insulina. La estimación del filtrado glomerular se realizó mediante la ecuación MDRD-4. La clasificación de la anatomía valvular se realizó en base a los hallazgos intraoperatorios, además de la descripción ecocardiográfica previa a la cirugía.

Los tejidos extraídos durante la intervención fueron tratados durante 24 h con formol al 4% y, tras varios lavados con agua, conservados en etanol 70% a 4°C en el Biobanco del Principado de Asturias. También se extrajo una muestra de sangre periférica en tubo con EDTA, que fue procesada en el Biobanco para la extracción del ADN genómico, que fue almacenado a -20º C hasta su utilización. Los pacientes firmaron un consentimiento informado para la utilización de sus muestras biológicas y el estudio fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica Regional del Principado de Asturias.

Genotipado

El polimorfismo 1G>2G en la posición -1607 del gen MMP1 (rs1799750) fue genotipado por reacción en cadena de la polimerasa y posterior digestión con un enzima de restricción (PCR-RFLP), siguiendo un procedimiento descrito previamente [10].

Cuantificación del contenido en calcio del velo aórtico

Las muestras de tejido valvular conservadas en etanol fueron analizadas mediante microtomografía computarizada (microCT) en un equipo SkyScan 1174 (Bruker, Kontich, Bélgica) disponible en el Bioterio de la Universidad de Oviedo. Las imágenes fueron obtenidas utilizando unos parámetros de 50 kV y 800 µA. Se obtuvieron unas 1.300 imágenes de cada una de las muestras con un paso de rotación de 0,3° y un promedio de marco de 2 para un escaneo de 180°. El escaneo de cada una de ellas duró entre 10 y 20 minutos (dependiendo del tamaño de la válvula) usando un tiempo de exposición de 6.200 ms. Se realizó la corrección de campo plano al principio de cada escaneo.

Las imágenes obtenidas fueron reconstruidas con el programa informático NRecon (Bruker) (Figura 1). Los valores de corrección del coeficiente de atenuación, dureza del rayo, suavizado y artefactos de anillo fueron los mismos en todas las muestras.

El análisis morfométrico en 3D fue realizado mediante el programa informático CTAn (Bruker). El volumen de interés fue delimitado manualmente en cada una de las muestras. El umbral que se usó para todas ellas fue de 0,74-3,39 g/cm3 de densidad mineral ósea (DMO).

Se consideraron los parámetros de DMO y el cociente volumen óseo/volumen total (BV/TV) como medidas de la cantidad de calcio depositado.

Análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo utilizando el programa informático SPSS versión 15.0. En primer lugar se confirmó que las frecuencias alélicas y genotípicas del polimorfismo estuviesen en equilibrio de Hardy-Weinberg mediante una prueba χ2. Se utilizó una prueba ANOVA para comparar los valores medios de los parámetros estudiados en los diferentes genotipos y, posteriormente, un test de Bonferroni para discriminar a qué parejas de genotipos se debía la significación estadística. Seguidamente, en función de estos resultados, se agruparon los genotipos en dos categorías cuyos valores medios para la DMO y el BV/TV se compararon mediante una prueba T. Por último, se realizó un análisis de regresión lineal corregido por las variables sexo, edad, filtrado glomerular medido utilizando la fórmula MDRD-4 y presencia de válvula aórtica bicúspide. Un p-valor <0,05 fue considerado como estadísticamente significativo.

Resultados

Los individuos analizados se encuentran en equilibrio de Hardy-Weinberg para el polimorfismo -1607 1G>2G, con una frecuencia de 0,49 para el alelo minoritario (1G en nuestra población), similar a la de otras poblaciones europeas (dbSNP).

Se calcularon los valores medios de DMO y BV/TV en los grupos de población definidos por los distintos genotipos para el polimorfismo -1607 de MMP1 y se encontraron diferencias en ambas variables, aunque éstas eran estadísticamente significativas sólo en el caso del BV/TV (Tabla 2).

Mediante un análisis post hoc se comprobó que presentaban diferencias significativas los individuos homocigotos para el alelo 2G frente a los homocigotos para 1G (p=0,042), con valores de contenido en calcio en los individuos heterocigotos similares a los de los homocigotos para el alelo 2G. Así, aplicando un modelo de herencia recesiva para el efecto del alelo 1G, se comprobó que los portadores del alelo 2G presentaban valores significativamente más altos de contenido en calcio en la válvula aórtica (3 veces en la DMO y 2 veces en el BV/TV) que los no portadores (valores de DMO de 62,52±10,99 mg/cm3 en portadores del alelo 2G frente a 20,08±8,54 mg/cm3 en homocigotos para el alelo 1G; y valores de BV/TV de 5,44±0,62% en portadores del alelo 2G frente a 2,52±0,59% en homocigotos para el alelo 1G) (Figura 2). Estas diferencias significativas se mantuvieron para los niveles de BV/TV tras el ajuste por sexo, edad, presencia de válvula aórtica bicúspide y filtrado glomerular (p=0,021), manteniendo la tendencia, aunque sin llegar a ser significativa, para los niveles de DMO (p=0,073).

Discusión

Este estudio es el primero en el que se describe una asociación entre un polimorfismo del gen MMP1 y la cantidad de calcio presente en las válvulas aórticas. La literatura recoge diversas asociaciones de variantes de este gen con otras afecciones cardiovasculares [11-13]. Entre estas variantes, una de las más estudiadas es el polimorfismo 1G>2G en la región promotora del gen, pues el alelo de la inserción confiere una mayor actividad transcripcional [14] que puede tener efectos en la célula y, por tanto, en el organismo. Así, se observó un incremento significativo del riesgo de padecer aterosclerosis en la arteria carótida en individuos portadores del alelo 2G [15] y una mayor presencia de este alelo en pacientes que habían sufrido ictus isquémico [16]. Sin embargo, hasta ahora no se habían descrito asociaciones de este polimorfismo y la enfermedad de la válvula aórtica calcificada, a pesar de que las MMPs juegan un papel importante en su fisiopatología [17,18].

Dos aspectos importantes en el desarrollo de la enfermedad de la válvula aórtica calcificada son la inflamación y el remodelado de la matriz extracelular [5]. Ambos son modulados por las células intersticiales de la válvula (VIC), las cuales pasan de un estado de reposo en el que conservan la homeostasis tisular, a un estado activado en el que toman características de miofibroblastos [19]. Las VIC activadas responden a la inflamación secretando, entre otros muchos factores, MMPs, lo que contribuirá a la acumulación de tejido fibroso desorganizado, a mantener las válvulas en un estado de inflamación crónica e inducirá la diferenciación osteoblástica de las VIC. Este último acontecimiento favorecería y aceleraría el depósito de calcio, que tendría como consecuencia la reducción de la función valvular [20].

La interacción entre las células y la matriz extracelular que las contiene es fundamental en la fisiología y funcionalidad del tejido valvular y puede afectar al fenotipo de las VIC [3]. La matriz extracelular de las válvulas cardiacas está constituida hasta en un 90% por colágeno y, de hecho, un depósito excesivo de la proteína, acompañado de un alineamiento alterado de sus fibras, incrementa la rigidez del tejido [21]. Existen diversos estudios en los que se ha demostrado el papel crucial del colágeno en la calcificación de las válvulas aórticas [22-24]. En concreto, en cultivo in vitro de velos de válvula aórtica porcina tratados con colagenasa se observó un aumento en la cantidad de colágeno y, simultáneamente, una disminución en la cantidad de otros componentes de la matriz extracelular como el ácido hialurónico [23]. Asimismo, se detectó un incremento tanto en la proliferación como en la apoptosis de las VIC, las cuales expresaron marcadores asociados a un fenotipo de miofibroblasto (alfa-actina de músculo liso) y de osteoblasto (fosfatasa alcalina, osteocalcina y sialoproteína ósea) resultando en un aumento de la mineralización del tejido [23].

La MMP-1, también conocida como colagenasa de fibroblastos, degrada los tipos de colágeno intersticial I, II y III. En consecuencia, el incremento de su actividad favorecería la destrucción de colágeno, la diferenciación osteoblástica y la calcificación. Los resultados experimentales obtenidos en este estudio sustentan este razonamiento, asociándose las mayores cantidades de calcio en las válvulas a aquellos individuos portadores del alelo que produce una mayor transcripción del gen y, consecuentemente, una mayor cantidad de proteína MMP-1. Visto de otro modo, la falta del efecto protector que ejercería en los pacientes una menor transcripción (proporcionada por el alelo menos activo) facilitaría el desarrollo de calcificación en la válvula aórtica.

Una limitación de este trabajo es que el número de pacientes estudiados es reducido y además se trata de un estudio transversal. No obstante, se ha constatado la asociación con el polimorfismo 1G>2G, sugiriendo un efecto protector del alelo 1G que será necesario comprobar en muestras de mayor tamaño y en otras poblaciones con objeto de comprobar si este hallazgo podría utilizarse en el futuro como predictor de calcificación y estenosis valvular aórtica.

Conflicto de intereses: Los autores declaran que no hay conflicto de intereses.

Financiación: Trabajo financiado en parte por el proyecto del Instituto de Salud Carlos III PI10/00173-Fondos FEDER.


BIBLIOGRAFÍA:

1. Iung B, Vahanian A. Epidemiology of valvular heart disease in the adult. Nat Rev Cardiol. 2011;8:162-72.

2. Towler DA. Molecular and cellular aspects of calcific aortic valve disease. Circ Res. 2013;113:198-208.

3. Wang H, Leinwand LA, Anseth KS. Cardiac valve cells and their microenvironment--insights from in vitro studies. Nat Rev Cardiol. 2014;11:715-27.

4. Apte SS, Parks WC. Metalloproteinases: A parade of functions in matrix biology and an outlook for the future. Matrix Biol. 2015;44-46:1-6.

5. Parks WC, Wilson CL, Lopez-Boado YS. Matrix metalloproteinases as modulators of inflammation and innate immunity. Nat Rev Immunol. 2004;4:617-29.

6. Kaden JJ, Dempfle CE, Grobholz R, Fischer CS, Vocke DC, Kiliç R, et al. Inflammatory regulation of extracellular matrix remodeling in calcific aortic valve stenosis. Cardiovasc Pathol. 2005;14:80-7.

7. Edep ME, Shirani J, Wolf P, Brown DL. Matrix metalloproteinase expression in nonrheumatic aortic stenosis. Cardiovasc Pathol. 2000;9:281-6.

8. Martin M, Pichel IA, Florez Munoz JP, Naves-Díaz M, Palacín M, Cannata-Andía JB, et al. Low transcriptional activity haplotype of matrix metalloproteinase 1 is less frequent in bicuspid aortic valve patients. Gene. 2013;524:304-8.

9. Yamada Y, Ando F, Niino N, Shimokata H. Association of a polymorphism of the matrix metalloproteinase-1 gene with bone mineral density. Matrix Biol. 2002;21:389-92.

10. Roman-Garcia P, Coto E, Reguero JR, Cannata-Andía JB, Lozano I, Avanzas P, et al. Matrix metalloproteinase 1 promoter polymorphisms and risk of myocardial infarction: a case-control study in a Spanish population. Coron Artery Dis. 2009;20:383-6.

11. Han Y, Wu Z, Zhang X, Yan C, Xi S, Yang Y, et al. Impact of matrix metalloproteinase-1 gene variations on risk of acute coronary syndrome. Coron Artery Dis. 2008;19:227-30.

12. Ye S. Influence of matrix metalloproteinase genotype on cardiovascular disease susceptibility and outcome. Cardiovasc Res. 2006;69:636-45.

13. Pearce E, Tregouet DA, Samnegard A, Morgan AR, Cox C, Hamsten A, et al. Haplotype effect of the matrix metalloproteinase-1 gene on risk of myocardial infarction. Circ Res. 2005;97:1070-6.

14. Rutter JL, Mitchell TI, Buttice G, Meyers J, Gusella JF, Ozelius LJ, et al. A single nucleotide polymorphism in the matrix metalloproteinase-1 promoter creates an Ets binding site and augments transcription. Cancer Res. 1998;58:5321-5.

15. Djuric T, Stojkovic L, Zivkovic M, Kon?ar I, Stankovi? A, Djordjevi? A, et al. Matrix metalloproteinase-1 promoter genotypes and haplotypes are associated with carotid plaque presence. Clin Biochem. 2012;45:1353-6.

16. Chehaibi K, Hrira MY, Nouira S, Maatouk F, Ben Hamda K, Slimane MN. Matrix metalloproteinase-1 and matrix metalloproteinase-12 gene polymorphisms and the risk of ischemic stroke in a Tunisian population. J Neurol Sci. 2014;342:107-13.

17. Fondard O, Detaint D, Iung B, Choqueux C, Adle-Biassette H, Jarraya M, et al. Extracellular matrix remodelling in human aortic valve disease: the role of matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors. Eur Heart J. 2005;26:1333-41.

18. Soini Y, Satta J, Maatta M, Autio-Harmainen H. Expression of MMP2, MMP9, MT1-MMP, TIMP1, and TIMP2 mRNA in valvular lesions of the heart. J Pathol. 2001;194:225-31.

19. Chen JH, Yip CY, Sone ED, Simmons CA. Identification and characterization of aortic valve mesenchymal progenitor cells with robust osteogenic calcification potential. Am J Pathol. 2009;174:1109-19.

20. Li C, Xu S, Gotlieb AI. The progression of calcific aortic valve disease through injury, cell dysfunction, and disruptive biologic and physical force feedback loops. Cardiovasc Pathol. 2013;22:1-8.

21. Rajamannan NM, Evans FJ, Aikawa E, Grande-Allen KJ, Demer LL, Heistad DD, et al. Calcific aortic valve disease: not simply a degenerative process: A review and agenda for research from the National Heart and Lung and Blood Institute Aortic Stenosis Working Group. Executive summary: Calcific aortic valve disease-2011 update. Circulation. 2011;124:1783-91.

22. Rodriguez KJ, Masters KS. Regulation of valvular interstitial cell calcification by components of the extracellular matrix. J Biomed Mater Res A. 2009;90:1043-53.

23. Rodriguez KJ, Piechura LM, Porras AM, Masters KS. Manipulation of valve composition to elucidate the role of collagen in aortic valve calcification. BMC Cardiovasc Disord. 2014;14:29.

24. Eriksen HA, Satta J, Risteli J, Veijola M, Väre P, Soini Y. Type I and type III collagen synthesis and composition in the valve matrix in aortic valve stenosis. Atherosclerosis. 2006;189:91-8.