( PDF ) Rev Osteoporos Metab Miner. 2011; 3 (2): 95-100

Pérez Castrillón JL1, Riancho Moral JA2, De Luis D1, Caeiro Rey JR3, Guede Rodríguez D4, González Sagrado M1,
Ruiz Mambrilla M5, Domingo Andrés M1, Primo Martín D1
1 Hospital Universitario del Río Hortega – Instituto de Endocrinología – Reticef – Valladolid
2 Hospital Universitario Marqués de Valdecilla – Universidad de Cantabria – Reticef – Santander
3 Complexo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela (CHUS) – Reticef – Santiago de Compostela
4 Trabeculae® Empresa de Base Tecnológica, S.L. – Ourense
5 Centro Médico de Rehabilitación y Lenguaje – Valladolid

 

Resumen
Fundamento: Los efectos de la diabetes tipo 2 en la microestructura y la masa ósea no están claramente definidos. El objetivo de este estudio ha sido valorar las propiedades microestructurales y la densidad mineral ósea volumétrica en ratas Goto-Kakizaki, modelo de ratas con diabetes tipo 2 sin sobrepeso que intenta soslayar la influencia de la obesidad sobre la masa ósea.
Material y métodos: Se diseñó un estudio experimental con ratas Goto-Kakizaki frente a un grupo control de ratas Wistar no diabéticas de peso similar y con glucemias normales, realizándose estudios densitométricos y microestructurales de la región distal del fémur mediante microtomografía computarizada de rayos X (micro-CT).
Resultados: En la densitometría volumétrica no se encontraron diferencias significativas entre los grupos. El estudio microestructural mostró que el BV/TV y la conectividad trabecular estaban disminuidos en las ratas diabéticas, a la vez que aumentaban las trabéculas en forma de tubo en detrimento de las trabéculas en forma de placa.
Conclusión: El deterioro de la calidad ósea trabecular podría explicar el descenso de la resistencia biomecánica ósea en la diabetes tipo 2.
Palabras Clave: diabetes tipo 2, microtomografía de rayos X, densidad mineral ósea, microestructura ósea.

Introducción

Los trastornos esqueléticos en la diabetes son diferentes según se trate de diabetes tipo 1 o tipo 2. Los pacientes con diabetes tipo 1 tienen un descenso de la masa ósea, que implica un riesgo de fractura aumentado1,2, mientras que los diabéticos tipo 2 pueden presentar una masa ósea incrementada, disminuida o dentro de límites normales3,4. Sin embargo, el riego de fractura en la diabetes tipo 2 está incrementado5,6. Este hecho puede deberse tanto a causas óseas como a causas extraóseas (retinopatía, neuropatía, fármacos, etc.) que determinan una mayor incidencia de caídas. Un hecho frecuente en los diabéticos tipo 2 es el sobrepeso, que constituye un factor de confusión debido a que el peso es un factor determinante de la masa ósea. Los obesos presentan normalmente una densidad mineral ósea elevada. Para evitar la influencia de este factor de confusión se diseñó un estudio experimental con ratas Goto-Kakizaki (GK), subcepa de rata Wistar no obesa que desarrolla diabetes tipo 2. Las ratas GK presentan una diabetes tipo 2 leve-moderada que ocurre tras el nacimiento y desarrollan complicaciones crónicas de la enfermedad, como neuropatía, retinopatía y nefropatía7.
El objetivo principal del estudio fue la valoración mediante microtomografía computarizada la densitometría y las propiedades microestructurales trabeculares y corticales de ratas GK, y compararlas con un grupo de ratas Wistar empleado como control, con el propósito de evaluar y en su caso definir los cambios que en estas variables induce la obesidad.

Material y métodos
Modelos animales

Se realizó un estudio experimental con 4 ratas GK macho frente a un grupo control de 4 ratas Wistar (WI) macho no diabéticas de peso similar y con glucemias normales (Taconic Farms Inc., Lille Skensved, Dinamarca), debido a que la subcepa Goto-Kakizaki ha sido desarrollada a partir de ratas Wistar. El tratamiento de los animales y todos los experimentos se llevaron a cabo conforme a la Ley 14/2007 y al Real Decreto 1201/2005, y siguiendo las directrices de las normas UNE-EN 30993-3:1994 y ISO 10993-2:2006. Las ratas se alimentaban con una dieta estándar teniendo acceso de forma libre al agua, sin recibir tratamiento farmacológico, y fueron sacrificadas a las 12 semanas en una cámara con CO2.

Análisis microestructural óseo mediante micro-CT

Una vez sacrificados los animales, se extrajeron los fémures derechos para la realización del análisis microestructural. Tras la extracción, las muestras se conservaron envueltas en una gasa empapada en solución salina y se conservaron a -20°C hasta los momentos previos al análisis. El estudio microestructural de las muestras se llevó a cabo mediante microtomografía computarizada de rayos X (micro-CT) empleando el equipo comercial SkyScan 1172 (SkyScan NV, Aarstelaar, Bélgica) en el laboratorio de investigación de Trabeculae®, Empresa de Base Tecnológica, S.L. (Ourense, España).
La región distal de cada fémur se escaneó con un voltaje de la fuente de rayos X de 50 KV y una intensidad de 200 µA, empleando un tamaño de vóxel de 8,95 µm. Se colocó un filtro de aluminio de 0,5 mm de espesor para reducir los artefactos de beam hardening. El paso de rotación empleado fue de 0,4° hasta un total de 180° y el tiempo de exposición de 1250 ms.
Las imágenes obtenidas se reconstruyeron empleando el algoritmo modificado de Feldkamp8 mediante la aplicación NRecon 1.5 (SkyScan NV, Aarstelaar, Bélgica). Las secciones transversales resultantes después de la etapa de reconstrucción se emplearon para el análisis cuantitativo de la microestructura ósea trabecular y cortical mediante la aplicación CTAn 1.10.0.2 (SkyScan NV, Aarstelaar, Bélgica), tras su segmentación en imágenes binarias utilizando un thresholding de adaptación local9.
Para el análisis del hueso trabecular se seleccionó una región de interés metáfiso-diafisaria (hueso cortical excluido) de 2,5 mm comenzando a una distancia de 1,0 mm de la placa de crecimiento en dirección proximal. Para el análisis de las propiedades microestructurales del hueso cortical se tomó una región de interés de 1,0 mm comenzando a 4,0 mm de la placa de crecimiento (Figura 1).
Las variables cuantitativas que se determinaron para la región trabecular fueron: fracción volumétrica ósea (BV/TV), superficie específica ósea (BS/BV), densidad de superficie ósea (BS/TV), grosor trabecular (Tb.Th), separación trabecular (Tb.Sp), número trabecular (Tb.N), factor de patrón trabecular (Tb.Pf), índice de modelo estructural (SMI) y grado de anisotropía (DA). Las distintas variables se midieron directamente utilizando métodos descritos en la literatura10,11. Las variables no métricas, SMI y Tb.Pf, se calcularon directamente del modelo tridimensional. El SMI indica la prevalencia relativa de trabéculas en forma de placa (plate-like) o trabéculas en forma de tubo (rod-like), indicando mayor presencia de placas cuanto más se acerca el valor a cero12. Por su parte, el Tb.Pf es un índice inverso de conectividad, medido a partir del cálculo de la convexidad y concavidad relativa de la superficie ósea13. A mayor valor de Tb.Pf la red trabecular muestra una peor conectividad, que lleva implícita una disminución de la resistencia mecánica. El DA es una medida de la alineación de las trabéculas en una determinada dirección, calculado de manera que 0 es la isotropía total y 1 la anisotropía total.
En el caso de la región cortical, los parámetros calculados incluyeron: grosor de la sección transversal (Cs.Th), grosor cortical (Ct.Th), el área transversal media de hueso (B.Ar), el momento de inercia polar medio (I) y la excentricidad (Ecc). El I es un índice básico de resistencia mecánica que indica la resistencia a la rotación de una sección transversal en un eje determinado (asumiendo propiedades biomecánicas materiales uniformes). La Ecc es un parámetro que indica la diferencia de alargamiento de la sección transversal con respecto a una forma circular (un círculo se considera una elipse con excentricidad cero).

Determinación de la densidad mineral ósea volumétrica

Utilizando las imágenes obtenidas mediante micro-CT, se ha determinado la densidad mineral ósea volumétrica (DMOv) tanto de la región cortical como de la región trabecular. Se ha empleado calibración directa frente a coeficientes de atenuación de patrones de hidroxiapatita de calcio de densidad conocida (250 y 750 mg/cm3). El método de cálculo de la DMOv difiere ligeramente en una u otra región ósea, ya que en el caso de la región trabecular se refiere a un volumen de hueso y tejido medular, mientras que en el caso de la región cortical se limita a un volumen ocupado únicamente por hueso lamelar calcificado.

Análisis estadístico

Los datos obtenidos se introdujeron en una base de datos de texto que se exportó al paquete estadístico IBM SPSS Statistics 19 (IBM Corporation, Somers, NY, EE.UU.) para su posterior análisis estadístico. Los resultados individuales se revisaron para evitar pérdida de datos y valores inusuales. Seguidamente se procedió con el análisis descriptivo de las variables de estudio. Los datos estadísticos descriptivos de las variables numéricas se expresaron como media ± desviación estándar, valor máximo y valor mínimo.
El estudio estadístico comparativo de los datos numéricos se llevó a cabo mediante análisis de la varianza de un solo factor (ANOVA) y test de HSD de Tukey para las comparativas múltiples. En aquellos casos en los que no se cumplieron los criterios de homogeneidad de las varianzas, se aplicó el test de Brown-Forsythe para el análisis de las varianzas y el test de Games-Howell para las comparativas múltiples.
El nivel de significación estadística se estableció en valores de p<0,05 para todas las variables analizadas.

Resultados

Las ratas GK presentaban un peso de 385 ± 23 g y una glucemia de 195 ± 84 mg/dL que confirma la presencia de diabetes en este grupo, mientras que las ratas Wistar tenían un peso de 395 ± 35 g y una glucemia de 124 ± 15 mg/dL (p<0,01). Los resultados de la densidad mineral ósea volumétrica aparecen reflejados en la Tabla 1. La DMOv no mostró diferencias entre los grupos, ni en el compartimento cortical, ni en el trabecular. A pesar de que parece haber una pérdida de masa ósea trabecular en las ratas diabéticas, esta no llega a ser significativa, probablemente debido al tamaño muestral empleado o al tiempo de evolución de la diabetes.
En la Tabla 2 se muestran los resultados de las variables microestructurales de la región trabecular. Se observaron diferencias estadísticamente significativas en la fracción volumétrica ósea (BV/TV) indicando una pérdida de hueso trabecular en las ratas diabéticas frente al grupo control. El considerable aumento del Tb.Pf en las ratas GK confirma, además, una importante pérdida de conectividad trabecular en la diabetes. Por otro lado, el incremento del SMI muestra una prevalencia de trabéculas en forma de tubo en las ratas diabéticas en comparación con el grupo control, en el que hay predominio de trabéculas en forma de placa. Aunque el BS/TV, el Tb.Th y el Tb.N están disminuidos en las ratas diabéticas, al mismo tiempo que la Tb.Sp está aumentada, indicando todo ello un deterioro de la microarquitectura trabecular (Figura 2), sus valores no han alcanzado significatividad estadística.
En la región cortical, aunque en el grupo diabético parece haber una disminución del grosor de la pared cortical, ya sea determinado con las secciones transversales (Cs.Th) o bien asumiendo el modelo tridimensional (Ct.Th), no se llega a la significatividad estadística (Tabla 3). Las variables B.Ar, I y Ecc muestran valores muy similares entre ambos grupos. Las regiones corticales de dos muestras representativas se pueden observar en la Figura 3.

Discusión

El estudio realizado muestra que las ratas diabéticas tienen una densidad ósea volumétrica similar a las ratas no diabéticas. Sin embargo, se observan diferencias en el hueso trabecular en los parámetros estructurales. Existe una disminución del BV/TV, una menor conectividad de las trabéculas y un predominio de trabéculas cilíndricas en las ratas GK. Las variables estructurales trabeculares en las que existen diferencias significativas entre las ratas diabéticas y las ratas control son las más relacionadas con la resistencia del hueso. La menor cantidad de hueso indicada por el descenso del BV/TV y la gran pérdida de conectividad trabecular revelada por el aumento del Tb.Pf en el grupo diabético, conllevan una disminución evidente de la resistencia biomecánica. Además, se ha demostrado que las trabéculas en forma de tubo, predominantes en el grupo diabético, son menos resistentes a las cargas mecánicas que las trabéculas en forma de placa12, más abundantes en el grupo control, según se deduce del valor del SMI. Todos estos datos indican que, aunque su densidad ósea sea normal, las ratas GK presentarían una menor resistencia biomecánica, lo que podría sugerir que la mayor prevalencia de fracturas existente en la diabetes tipo 2 estaría en relación con una alteración de la calidad ósea.
Hay pocos estudios realizados con este modelo experimental. Zhang et al. midieron en un grupo de ratas GK la densidad mineral ósea por DXA y la microestructura con técnicas histomorfométricas clásicas en 2D7. Estos autores encontraron una disminución de la masa ósea y una alteración de la histomorfometría con un descenso del BV/TV, similar al encontrado en nuestro estudio. Ahmad et al., empleando tomografía computarizada cuantitativa periférica (pQCT), observaron un descenso de la densidad mineral ósea volumétrica predominando en el compartimento trabecular14. Las mediciones se realizaron en húmero, tibia y metatarsianos de ratas hembra, lo que podría explicar las diferencias observadas con nuestros resultados. En ninguna de las regiones analizadas en ese trabajo se encontraron diferencias a nivel cortical. Sin embargo, en otro trabajo, empleando técnicas radiogramétricas en un grupo de 10 ratas GK, se observó un descenso del grosor cortical en metatarsiano y húmero15. Los datos observados son heterogéneos debido probablemente a las diferentes técnicas empleadas y los distintos lugares de medición. Sin embargo, en todos ellos predomina la afectación trabecular y, cuando se ha determinado, una disminución de la resistencia biomecánica ósea. Otro modelo de rata diabética no obesa es el de las ratas Zucker, desarrollándose la enfermedad de forma progresiva hasta presentar complicaciones graves de la misma. Estas ratas presentan descenso de la masa ósea, tanto a nivel cortical como trabecular, tamaño inferior de los huesos largos y deterioro de las propiedades biomecánicas y microestructulares del hueso cortical y trabecular16,17.
Varios mecanismos pueden explicar esta alteración. La glucosa constituye la principal fuente energética de los osteoclastos siendo la hiperglucemia responsable de un incremento de la actividad osteoclástica, con aumento del remodelado óseo y descenso de la cantidad y calidad ósea2. Por otra parte, la hiperglucemia provoca la glucosilación no enzimática de proteínas del hueso dañando la calidad ósea18. A su vez, la glucosuria incrementa la hipercalciuria con cambios en el sistema PTH/vitamina D. Estos efectos deletéreos sobre la calidad ósea pueden ser parcialmente compensados por el incremento de la masa ósea asociada a la obesidad19. Una alteración del metabolismo del calcio también puede contribuir al deterioro de la calidad ósea. En diabéticos se ha descrito un aumento de la calciuria que se ha relacionado con la hiperglucemia y glucosuria. Ello provoca un hiperparatiroidismo secundario que ejerce un efecto perjudicial sobre el hueso, especialmente sobre el compartimento trabecular20. La alteración del metabolismo de la vitamina D y de la parathormona es particularmente prominente en pacientes con función renal reducida. La microangiopatía puede alterar la función endotelial21 y la macroangiopatía con aterosclerosis puede conducir a reducción del aporte sanguíneo a los huesos22,23. Por otra parte, en pacientes con neuropatía la alteración en la carga sobre los huesos también puede contribuir a la pérdida de masa ósea. Podemos decir por tanto, que existen múltiples mecanismos que ejercen un efecto deletéreo sobre el hueso en animales de experimentación con diabetes tipo 2 que pueden explicar la alteración de la calidad ósea en estos modelos.
Como conclusión, podemos decir que las ratas Goto-Kakizaki constituyen un modelo válido para el estudio de la diabetes tipo 2, ya que elimina un importante factor de confusión, el sobrepeso. Aunque el tamaño muestral es pequeño, hemos encontrado un deterioro de la microestructura a nivel trabecular en fémur, conservándose sin embargo la densidad mineral ósea volumétrica.

 

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